Q：Passive Reference Dye的作用是什么，如何使用？
A：它們是針對(duì)不同機(jī)器型號(hào)校正加樣管間誤差的參比熒光染料。它們的濃度為50×，使用時(shí)在20μl體系中加入0.4μl即可。
Q：CT值出現(xiàn)過晚？
A：可能是擴(kuò)增效率低，反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。此外PCR各種反應(yīng)成分的降解或者PCR產(chǎn)物太長(zhǎng) (一般采用80-250 bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度) 也會(huì)造成CT值出現(xiàn)過晚。
Q：qPCR SuperMix是否需要調(diào)整Mg2+濃度？
A：一般不需要調(diào)整，當(dāng)PCR結(jié)果不理想或通過其它調(diào)整不能獲得明顯改善時(shí)，可以考慮通過調(diào)整Mg2+濃度以改進(jìn)擴(kuò)增結(jié)果。
Q：擴(kuò)增曲線異常？
A：
? 基線設(shè)置有誤。
? 高濃度的模板會(huì)導(dǎo)致CT值過早出現(xiàn)，即基線范圍變小，導(dǎo)致機(jī)器讀取熒光數(shù)值有誤。
Q：重復(fù)性差？
A：
? 操作誤差。
? 模板濃度過低會(huì)導(dǎo)致重復(fù)性變差，可適當(dāng)提高模板濃度，降低稀釋倍數(shù)。
? 機(jī)器本身的孔間溫度不一致。
Q：NTC不為零，如何優(yōu)化？
A：
? 提高退火溫度。
? 降低引物工作濃度，如需要可降至60 nM。
? 盡量在冰上操作。
? 重新設(shè)計(jì)引物，必要時(shí)可設(shè)計(jì)多對(duì)引物，優(yōu)中選優(yōu)。
